De gescheiden Larry Daley (Ben Stiller) heeft altijd pech. Maar wanneer hij met enige tegenzin een baan als nachtbewaker in het Historisch Museum accepteert, zou hij wel eens een cruciale rol in de wereldgeschiedenis kunnen gaan spelen. Want 's nachts gebeuren er wel heel eigenaardige dingen in het museum: iedereen en alles komt tot leven! Met de hulp van het wassenbeeld van President Teddy Roosevelt (Robin Williams) probeert Larry de vechtende Romeinse gladiatoren en Amerikaanse cowboys weer op gelijke voet te krijgen en de rondrennende T-Rex bewijst waarom hij bekend staat als het gevaarlijkste roofdier ter wereld. Larry zal de samenzwering binnen het museum op moeten lossen om ervoor te zorgen dat de deuren niet voorgoed zullen sluiten.